基孔肯雅病毒核酸检测试剂技术审评要点来了！

前言

近期，广东、广西等地相继报告基孔肯雅热本地感染病例，引发公共卫生部门高度警惕。

如今正值我国基孔肯雅疫情防控的关键时期，在此背景下，8月28日，国家药监局器审中心发布《基孔肯雅病毒核酸检测试剂技术审评要点（试行）》（以下简称《审评要点》），我们将其中第二部分注册审查要点的“分析性能研究”内容转载如下：

注册申请人应采用在符合质量管理体系的环境下生产的试剂盒进行分析性能研究，提交具体研究方法、试验方案、试验数据、统计分析结果等详细资料。

如申报产品适用不同的机型，需要提交采用不同机型进行性能评估的资料。如申报产品包含不同的包装规格，需要对各包装规格进行分析或验证。

如果试剂同时适用于血清和血浆样本类型，可选择具有统计学意义数量的样本进行不同样本类型一致性的同源比对研究。

分析性能评估所用样本的基本信息均需明确，例如样本来源、样本类型、采集和处理方式、稀释方式、定值过程及数据等。

分析性能评估用样本一般应为真实样本，如需稀释，应采用阴性样本进行稀释。

建议着重对以下分析性能进行研究。

1.样本稳定性

2.核酸（RNA）提取/纯化性能

在进行核酸检测之前，建议有核酸提取/纯化步骤。该步骤的目的除最大量分离出目的RNA外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。对配合使用的所有核酸提取试剂进行提取核酸纯度、浓度、提取效率的研究，并与质量较好的核酸提取试剂进行平行比对。若产品适用两种或以上核酸提取试剂，则每一种核酸提取试剂均需配合检测试剂进行抗干扰、精密度和检出限的验证。

3.精密度

应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。应考虑运行、时间、操作者、仪器、试剂批次和地点等影响精密度的条件，设计合理的精密度试验方案进行评价。精密度评价试验应包含核酸提取步骤。设定合理的精密度评价周期，例如为期至少20天的检测。对检测数据进行统计分析，获得重复性、实验室内精密度、实验室间精密度、批间精密度等结果。

应至少包含3个水平：阴性样本、临界阳性样本、中/强阳性样本，并根据产品特性设定适当的精密度要求，例如：

阴性样本：待测物浓度为零浓度，阴性检出率应为100%（n≥20）。

临界阳性样本：待测物浓度略高于试剂盒的检出限，阳性检出率应≥95%（n≥20）。

中/强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

4.分析特异性

4.1交叉反应

4.1.1生物信息学分析

分析应当包括人基因组和其他近缘病毒、引起发热、关节疼痛、出疹等相似症状的病原体。

4.1.2样本验证

采用灭活的临床样本或添加了灭活病原体培养物的阴性临床样本进行验证，样本基质应与预期检测样本类型一致，交叉反应研究用样本主要考虑以下几方面：

4.1.2.1发热伴出疹相关病原体

登革病毒（DENV-1～DENV-4）、辛德毕斯病毒、盖塔病毒、黄热病毒、寨卡病毒、麻疹病毒、风疹病毒、乙型脑炎病毒*、水痘-带状疱疹病毒*、单纯疱疹病毒*、细小病毒B19*、人类疱疹病毒 6*、人类疱疹病毒 7*、肺炎衣原体*、志贺氏菌*、淋球菌*、溶血性链球菌*、立克次体*。

注：“*”项为选择性验证的病原体，可在其中选择不少于9个进行验证。

4.1.2.2可能在血液样本中存在的其他常见病原体

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、人巨细胞病毒。

4.1.2.3高浓度人类基因组DNA

病毒培养液的浓度单位可采用TCID50或PFU/mL，细菌培养物浓度单位可采用CFU/mL。建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的水平为106 CFU/mL或更高，病毒为105 PFU/mL或更高，也可采用其他合理的方法对病原体浓度进行定值，提交相关依据。

申请人应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别信息和浓度确认等试验资料。

4.2干扰

4.2.1干扰物质研究 

应根据所采集样本类型，针对可能存在的内源/外源物质干扰情况进行验证，验证推荐物质见表1。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行试验，检测包含临界阳性水平在内的基孔肯雅病毒样本。对结果进行合理的统计分析，对比添加干扰物质前后的Ct值差异。检测的潜在干扰物包括样本中的原有物质及在样本采集和处理期间引入的物质。

表1 用于干扰试验的物质

抗病毒药：如利巴韦林

解热镇痛药：如对乙酰氨基酚

抗生素：如阿莫西林

激素类药物：如地塞米松

抗凝剂：如肝素

内源性干扰物质：血红蛋白、甘油三酯、白蛋白、胆红素等

4.2.2病原体干扰研究

应充分考虑临床上容易与基孔肯雅病毒合并感染的病原体（如登革病毒等）及“4.1.1”中经生物信息学分析显示存在较高同源性的病原体，在高浓度的情况下对低浓度（例如检出限浓度）基孔肯雅病毒核酸检测的影响，进行干扰研究。

5.检出限

5.1检出限的确定

建议采用至少3个样本系列稀释于与适用样本一致的基质中，进行检出限的确定。每个浓度梯度重复检测，记录不同浓度检出的结果，采用适当的模型（如Probit分析）和分析方法，将具有95%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的检出限。

5.2检出限的验证

选择另外3个不同来源的样本在检出限浓度水平进行验证，应达到95%阳性检出率。

如检测试剂包括多个可单独报告的检测靶标，应分别进行检出限研究。

6.包容性

6.1 应当采用生物信息学分析方法对产品检测的包容性进行研究，对所有已公布的基孔肯雅病毒核酸序列进行序列比对分析，并对靶标范围内的序列差异是否影响申报产品检出能力进行分析验证。

6.2 验证至少10个不同来源的临床阳性样本。研究应包括检出限和重复性的验证。

6.3 基因型覆盖

应对基孔肯雅病毒主要基因型，包括西非型、东中南非型（包含印度洋分支）、亚洲型及其他流行变异株进行包容性研究。研究可采用毒株或临床样本，如果样本难以获得，亦可采用假病毒。

7.企业参考品验证

根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用三批产品对企业参考品进行检验并提供详细的试验数据。

以上仅对《审评要点》部分内容进行转载，如需查看全文，请添加文末小编微信或点击“阅读原文”。